हम KcsA, पोटेशियम चैनल K चैनल ऑफ़ स्ट्रेप्टॉमी A, आयन चैनल, सेल-फ्री प्रोटीन को नैनोडिस्क द्वारा पृथक करते हैं, जो सेल-फ्री अभिव्यक्ति के लिए E.coli lysates पर आधारित है।

हमारा सेल-फ्री प्रोटीन रहा हैकार्य की पुष्टि हुई।

परिचय

KCSA (Kre of streptomyces A) मिट्टी के जीवाणुओं से एक प्रोकैरियोटिक पोटेशियम चैनल है स्ट्रेप्टोमीज लिविडंसआयन चैनल अनुसंधान में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है।पीएच सक्रिय प्रोटीन के पास दो ट्रांसमीटर और एक उच्च चयनात्मक छिद्र क्षेत्र है, जो K के गेटिंग और शटरिंग के लिए जिम्मेदार है।⁺सेल से बाहर आयन।केसीए की चयनात्मकता फिल्टर में पाया जाने वाला एमिनो एसिड अनुक्रम प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक दोनों के बीच अत्यधिक संरक्षित है⁺वोल्टेज चैनल;परिणामस्वरूप, केसीएसए पर अनुसंधान ने कश्मीर के लिए आणविक आधार पर महत्वपूर्ण संरचनात्मक और यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान की है⁺आयन चयन और चालन।आज तक सबसे अधिक अध्ययन किए गए आयन चैनलों में से एक केकेएसए, K पर शोध के लिए एक टेम्प्लेट है⁺ चैनल फ़ंक्शन और इसकी विस्तृत संरचना प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक प्रजातियों दोनों के लिए चैनल गतिशीलता के कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग को रेखांकित करती है।

समारोह

केसीएसए चैनल को एक मॉडल चैनल माना जाता है क्योंकि केकेएसए संरचना K को समझने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करती है⁺चैनल चालन, जिसके तीन भाग हैं: पोटेशियम चयनात्मकता, पीएच संवेदनशीलता द्वारा चैनल गेटिंग और वोल्टेज-गेटेड चैनल निष्क्रियता।क⁺आयन पारगमन छिद्र के ऊपरी चयनात्मकता फ़िल्टर क्षेत्र में होता है, जबकि पीएच गेटिंग छिद्र के अंत में ट्रांसमेम्ब्रेन हेलीकॉप्टर के प्रोटॉन से उगता है।कम पीएच पर, एम 2 हेलिक्स को बंद कर दिया जाता है, आयन चैनल को बंद से खुले विरूपण में स्थानांतरित किया जाता है।चैनल के माध्यम से आयनों के प्रवाह के रूप में, वोल्टेज गेटिंग तंत्र को चयनात्मकता फ़िल्टर में Glu71 और Asp80 के बीच इंटरैक्शन को प्रेरित करने के लिए सोचा जाता है, जो प्रवाहकीय विरूपण को अस्थिर करता है और लंबे समय तक चलने वाले गैर-चालित राज्य में प्रवेश की सुविधा प्रदान करता है जो सी-टाइप-वोल्टेज की निष्क्रियता से मिलता-जुलता है। निर्भर चैनल।

पीएच 7, केकेएसए में केएससीए के गैर-संचालन में⁺चयनात्मकता फिल्टर के ऑक्सीजेंस के समन्वय के लिए कसकर बाध्य है और किसी भी पोटेशियम आयनों के मार्ग को अवरुद्ध करने के लिए चार टीएम 2 हेलिकॉप्टर साइटोप्लाज्मिक जंक्शन के पास अभिसरण करते हैं।पीएच 4 में, हालांकि, केसीएसए मिलीसेकंड-टाइमस्केल कंफर्मल एक्सचेंजों को अनुमति देता है और अनुमति देता है जो गैर-प्रवेश वाले राज्यों को फिल्टर करता है और एम 2 हेलिकॉप्टरों के खुले और बंद अनुरूपों के बीच होता है।जबकि ये अलग-अलग रूपांतर परिवर्तन चैनल के अलग-अलग क्षेत्रों में होते हैं, प्रत्येक क्षेत्र का आणविक व्यवहार इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन और ऑलस्टरी दोनों से जुड़ा हुआ है।फ़िल्टर में इस एक्सचेंज स्टीरियोकेमिकल कॉन्फ़िगरेशन की गतिशीलता एक साथ कश्मीर के लिए भौतिक आधार प्रदान करती है⁺ चालकता और गेटिंग।

संरचना

जीवाणु के क्रिस्टल संरचना (0.32 एनएम) के उद्भव के साथ (स्ट्रेप्टोमीज लिविडंस) पोटेशियम चैनल KcsA, आयन चैनल संरचना के लिए एक कीस्टोन दिया गया है।इसकी टोपोलॉजी को आंतरिक और बाहरी हेलिक्स के साथ बिटोपिक होने के लिए पहचाना गया है।दो हेलिकॉप्टर "ताकना हेलिक्स" और चयनात्मकता फिल्टर द्वारा जुड़े हुए हैं।चार सबयूनिट्स बाईलाइन को पार करने के लिए आयनों के लिए एक मार्ग को अस्तर करके चैनल बनाते हैं।आयन के पारित होने को साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर एक गेट पासिंग और वेस्टिब्यूल में स्थानांतरित करने के रूप में वर्णित किया जा सकता है जो आयन को तथाकथित आंतरिक हेलिक्स के द्विध्रुवीय क्षण के माध्यम से स्थिर करता है।आयनों को पहले से ही फिल्टर के भीतर स्थित पोटेशियम आयनों के साथ एक ठोस गति में चयनात्मकता दाखिल करने की आवश्यकता होती है।अपनी उच्च चयनात्मकता के साथ, KcsA आयन परमिट के संदर्भ में वोल्टेज-गेटेड K चैनल (Kv) के साथ समानता दिखाता है और टोपोलॉजी में आवक K चैनल के साथ समानता है।यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि केसीएस चैनल को पीएच परिवर्तनों द्वारा ट्रिगर किया जाता है।सोडियम पर पोटेशियम के लिए K चैनलों की विशाल चयनात्मकता के कारण का निर्णय करना आज तक एक चुनौती है।यह अनुमान है कि केसीएसए की संरचना एक बंद चरण का प्रतिनिधित्व करती है।एक प्रोकैरियोटिक की संरचना (0.33 एनएम) के साथ (मेथनोबैक्टीरियम थर्मोआटोट्रॉफिक)।सक्रियण के दौरान, आंतरिक हेलिकॉप्टर रेडियल जावक को धक्का देते हैं और साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर कसना खोलते हैं।यह उद्घाटन एक ग्लाइसिन अवशेषों के आसपास 99 की स्थिति (G99) पर टिका हुआ है।यह आयन चैनलों के लिए अब तक का सबसे स्पष्ट रूप से वर्णित परिवर्तन है।चयनात्मकता फ़िल्टर अपनी संरचनात्मक स्थिति में अपरिवर्तित रहता है और बाहरी हेलिक्स केवल सीमांत रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरता है।इस समीक्षा के संदर्भ के लिए एक निष्कर्ष के रूप में और Kcsa के संबंध में Vpu के लिए निष्कर्ष के संबंध में।

ई। कोलाई प्रणाली का लाभ

1. उच्च प्रोटीन उपज
2. सरल खेती और तेजी से सेल विकास और lysate तैयारी
3. लागत कुशल
4. आसान जेनेटिक इंजीनियरिंग
5. अच्छी तरह से स्थापित